君跻生物官网

寡核苷酸合成FAQ

Primer synthesis FAQ

TaqMan 探针设计的基本原则是什么?

下列原则可供您参考:
1)TaqMan探针位置尽可能靠近扩增引物(扩增产物50-150bp)，但不能与引物重叠。
2)长度一般为18-40 mer。
3)G-C含量控制在40-80%左右。
4)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
5)在引物的5'端避免使用G。
6)选用比较多的碱基C。
7)退火温度Tm控制在68-70C左右。

如何检测引物的纯度?

实验室常见方法是用PAGE法。使用加有7M尿素的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,碱基数小于12个的引物用20%的胶,12-60个碱基的引物用16%的胶,大于60个碱基的引物用12%的胶。取0.2-0.50D的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变(95C,2min)加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的。有时由于变性不充分,主带之上可能会有条带,乃是引物二级结构条带。)
另外纯度检测设备可以更加准确的确定引物纯度:
HPLC(高效液相色谱):根据物质吸附作用的不同来进行梯度洗脱分离。其作用机制是:当试样进入色谱柱时,溶质分子和溶剂分子对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附。(目前主要用的是反相柱);
CGE(毛细管电泳仪):以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术,达到纯度分析的效果。金斯瑞已经将其作为引物质量控制的重要手段之一。

已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了?

如果您溶解引物的水pH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻融，并使用10mMTrispH7.5缓冲液溶解引物。还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。

如何溶解引物?

干燥后的引物质地非常疏松，开启瓶盖溶解之前最好在3,000-4,000转/分钟的转速下离心1分钟，或管垂直向上在桌面上轻敲几次，将引物粉末收集到管底，防止开盖时引物散失。
根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mMTrispH7.5缓冲液，室温放置几分钟，上下混匀振荡，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5)，引物在这种条件下不稳定。我们的合成报告单给出了每管引物稀释为100uM(即100 pmopl)浓度的加水量，您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水(pH>6.0)或TE缓冲液(pH7.5-8.0)。

引物在常温下运输，会降解吗?

不会降解，冻干的引物在常温至少可以稳定存放2周以上。而一般的运输时间通常都在1-3天，所以您收到的引物不会降解

如何保存引物?

引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。没有溶解的引物非常稳定，-20℃下可保存2-3年，甚至更长。溶解后的引物-20℃下避免反复冻融，可以保存至少半年以上。如果对实验的重复性要求较高，合成的OD值较大或单条引物合成合成量较大的，建议将溶解好的引物事先稀释为100M的储存液，分装数份保存于-20C冰箱。使用前，将浓溶液稀释成工作液(10-20uM)后进行实验。荧光修饰引物需要避光保存。

联系销售

联系销售助理

联系PM