• ASO的作用体制

传统的基于反义寡核苷酸（ASO）的基因调控（包括基因表达的沉默或提高基因表达）以 mRNA 为目标，可以在细胞核或细胞质中发生作用。在细胞核中（靶向pre-mRNA前体），调控通常通过改变多聚腺苷酸化作用 、改变剪接事件或切割核苷酸间键来起作用，所有这些都发生在 mRNA 成熟过程中（图1）。在细胞质中（靶向成熟 mRNA），调控通常通过翻译调控或招募RNaseH切割起作用（图 2）    

图1. 细胞核中基于反义寡核苷酸的基因调控机制

图2. 细胞质中基于反义寡核苷酸的基因调控机制

反义寡核苷酸通过碱基配对识别并与目标mRNA杂交。导致目标mRNA被RNase H无论是在细胞核还是细胞质中。切割的反义寡核苷酸在研究和治疗目的方面得到了广泛研究，因此在调控机制方面也研究的相对透彻。RNase H使用镁离子作为辅助因子，通过水解核苷酸间（磷酸二酯）键来切割 mRNA:DNA 异源双链中的 mRNA 链。

• ASO设计考虑因素

原则上，基因沉默应该像在目标mRNA 中选择一个序列、采购互补的通过碱基配对的反义寡核苷酸、将其引入所研究的系统（无论是在体外还是体内），然后后续的分子生物学检测ASO作用效果。然而，设计反义寡核苷酸需要考虑许多因素。

• 杂交位点

根据碱基配对规则，反义寡核苷酸应该与目标mRNA序列的任何区域杂交。但是，mRNA会折叠成二级甚至三级结构，这可能会阻止反义寡核苷酸杂交。因此，应选择mRNA的非折叠区域作为杂交位点。有一些湿实验室方法，如RNase H定位，可用于预测可接近的位点，也可以通过预测 RNA二级结构做初步判断。

• 核酸酶降解

• 免疫刺激

细菌DNA中未甲基化的 CpG二核苷酸的频率比脊椎动物DNA高得多。这主要是因为CpG二核苷酸在脊椎动物基因组中代表性不足，并且其中80%被甲基化标记。由于细菌中的CpG基序会触发 B细胞、自然杀伤细胞、单核细胞和细胞因子的活化，而脊椎动物的CpG基序则不会，这可能是免疫系统识别细菌感染的方式之一。含有未甲基化 CpG基序的反义寡核苷酸以与细菌 DNA 类似的方式刺激免疫系统，并且可能是早期反义研究中一些报道的效应的原因。

为了避免免疫刺激，如果可能的话，设计不含 CpG 基序的反义寡核苷酸，或者至少不含以下产生最强免疫反应的扩展基序。

• 序列长度

最佳长度通常为12到28个碱基。短于12个碱基的序列会增加脱靶杂交的概率，而长于25个碱基的序列会导致细胞吸收率降低。

• 自身互补性

应检查反义寡核苷酸的二级结构和寡核苷酸二聚体的形成，因为这两者都可能干扰与靶位点序列的杂交。如果可能，设计反义寡核苷酸使其具有尽可能弱的二级结构且不形成二聚体。

• 功能基序

• 结合亲和力

如上所述，确定目标mRNA 中没有折叠的位点以及确保反义寡核苷酸没有自身互补性至关重要。然而，仅这些考虑因素不足以确保适当的杂交。各种因素，例如硫代磷酸酯会降低反义寡核苷酸对靶位点的结合亲和力，这反过来又会使减弱敲低效率。已发现第三代反义寡核苷酸修饰不仅具有抗核酸酶的特性，还能提高结合亲和力。

• 靶点检查

最终的未修饰反义寡核苷酸序列应进行 BLAST 搜索，以确保任何脱靶杂交（最好没有）不会干扰反义活性或导致不可接受的毒性。

• 质量考虑因素

原则上，基因沉默应该像在目标mRNA 中选择一个序列、采购互补的通过碱基配对的反义寡核苷酸、将其引入所研究的系统（无论是在体外还是体内），然后后续的分子生物学检测ASO作用效果。然而，设计反义寡核苷酸需要考虑许多因素。对于体内动物实验，我们建议反义寡核苷酸进行体内级纯化，包括离子交换、内毒素检测（确保热原低于可接受的上限）和过滤（将污染的菌落形成单位数量减少到可接受的上限以下）。

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